化学发光标记(Chemiluminescence labeling,CLL)及发光免疫分析( Luminescent immunoassy,LIA)是一种灵敏度高,特异性强、检测快速、无放射危害的分析技术。

本文带您详解该项技术的机理、实验技术及应用。

常用的化学发光特质有:鲁米诺(Luminol)和异鲁米诺(Isoluminol)及其衍生物(如:AE-BI)；咪唑类(如:咯粉碱)；吖啶酯类(如:光泽精)；苯酚类化合物(如:焦性没食子酸)及芳基草酸酯类(如:TCPO,DNPO)。

近年来提出了高量子效率、高稳定性的化学发光剂:1,2-二氧化环乙烷衍生物(如:AMPPD）

化学发光反应是由两个关键步骤组成:激发和发射。

反应体系中，A、B两种物质经化学反应生成一种激发态产物(C*),在它回到基态时,释放能量转变成光子(能量hυ),产生发光现象。反应式为:

A+B→C*+D

C*→hυ

化学发光反应的首要条件是反应必须提供足够的激发能,并释放光子。

通常只有反应速度相当快的放能反应,ΔH(焓)=170~300KJ/mol，才能在可见光范围观察到化学发光(CL)，而氧化还原反应所提供的能量介于其中，因此大多数化学发光反应为氧化还原反应。

化学发光强度(相对光单位 RLU,mv或 CPS)决定于CL反应速度，而反应速度又决定于反应分子的浓度，通过检测CL光强度，可以确定反应物的浓度。

化学发光反应机理有:生成过氧化物中间体反应(如:鲁米诺、TCPO等)，生成单线态氧'02(如焦性没食子酸等)；通过酶转化的生物发光(如:虫荧光素酶的生物发光ATP测定等)；电子转移的化学发光(如:芳香族化合物等)及生物体内的超弱发光等。

在化学发光免疫测定(CLIA)中，所用标记物有两种，一种是直接用发光物质(如:吖啶酯、ABEI等)标记抗体或抗原；另一种是以催化剂(如:HRP、COD等)或协同因子(如:ATPNAD 等)标记抗体或抗原。

按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点,可将标记物分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。

直接偶联是指通过偶联反应,使标记物分子中的反应基团直接联在被标记分子的反应基团上。如:碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法、混合酸酐法和 N一羧基琥珀酰亚胺活化法等均属于直接偶联。

间接偶联是在标记物与被标记物之间插人一条链或一个基团，使两种物质通过引进的“桥”联结成结合物,通过插人的“桥”，可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性，还可减弱参与偶联双方结构中存在的空间阻碍效应，如:琥珀酸酐法，0-(羟甲基)羟胺法，异硫氰酸酯衍生物法和戊二醛法等均属于间接偶联。

将发光反应与免疫反应结合起来,建立的发光免疫分析法,由两部分组成,即免疫反应系统和化学发光反应系统。在免疫反应系统方面,其原理与放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(ELA)，荧光免疫测定法(FLA)等基本相同，只是由于标记物的不同，测定方法各不相同。

发光反应系统中是以化学反应为基础的，该系统由发光化合物(如:ABEI、吖啶酯及AMPPD等)，氧化剂(如:H202、02、102及ROOH等),催化剂(如:HRP、MP等)组成。不同发光体系的反应条件、发光强度和波长等均有差别。

化学发光反应与免疫反应结合起来的发光免疫分析法具有灵敏度高(与RIA法同属一个水平)、快速、线性范围宽等优点。

近年来，国内外不少实验室建立了各种生物活性物质、药物细菌、病毒等的发光免疫测定并用于临床医学检测。

近年来,提出了酶标发光增强技术,用辣根过氧化物酶(HRP)标记生物分子，HRP作催化剂，H202作氧化剂,在鲁米诺一HRP-H202体系中,加入发光增强剂(如:对碘苯酚等)，使该发光体系的发光强度增大1000倍以上，且发光衰减缓慢，故增加了发光检测的灵敏度和特异性，提高了检测的稳定性等。

发光增强剂主要有:6-羟基苯并噻唑衍生物类(如:虫荧光素、脱氢荧光素等)，卤酚类(如对碘苯酚、对溴苯酚等)，萘酚类(如:β一萘酚、α-溴一β-萘酚等)，酚代用品(如:对苯基苯酚等)以及胺衍生物类(如:3-氨基荧蒽等)。

到目前为止，用化学发光标记技术测定物质有乙型肝炎表面抗体、血清铁蛋白、乙型肝炎表面抗原、HRP、乙型肝炎E抗体、乙型肝炎核心抗体、人血清甲胎蛋白、麻疹病毒抗体、D-氨基酸、细菌内毒素、巨细胞病毒抗体、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、α-甲胎蛋白、白朊、孕酮、雌三醇-16α-葡萄醛酸甙、雌三醇、皮质醇、地戈辛、178-雌二醇、脱氢表雄甾酮、孕甾酮、17α-羟基孕甾酮、二硝基酚、轮状病毒、抗DNA抗体等。

综上所述，化学发光标记物与放射性核素标记物相比较，具有安全(无放射危害)、稳定、测量快速等优点,发光免疫分析法已广泛应用于抗原、半抗原和抗体的检测。

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